卡他莫拉菌快速鉴定的方法学及耐药性研究
卡他莫拉菌(moraxellacatarrhalis,MC)为革兰阴性双球菌,原属奈瑟菌属(Neisseriacatarrhalis,NC),Catlin在年将此菌分类为布兰汉菌属(Branhamellacatarrhalis,BC),年在伯杰分类细菌学手册中被列为莫拉菌属的布兰汉亚属(subgenusbranhamella)。MC是人类上呼吸道的常居菌种,为条件致病菌。该菌可引起人类的多种感染,可累及全身。国外资料显示,MC在成人下呼吸道感染及儿童肺炎、中耳炎等标本中的分离率,仅次于流感嗜血杆菌和肺炎链球菌列第三位。因此,快速鉴定MC具有重要的临床意义。我们用3-乙酰吲哚纸片法检测乙酰酯酶,快速鉴定MC。并测定4种β内酰胺抗生素的复方制剂及亚胺培南/西司他丁对β内酰胺酶阳性MC的抗菌活性。报告如下。
材料和方法
一、材料
1.菌株来源:MC(株)、淋病奈瑟菌(15株)、脑膜炎奈瑟菌(3株)、奈瑟菌属(株)、莫拉菌亚属(24株)、博德特菌属(6株)、不动杆菌属(株)均为临床分离株。标准菌株MC,,为全国临床检验中心质控菌株,MC的ATCC、解乳糖奈瑟菌ATCC、淡黄色奈瑟菌ATCC、脑膜炎奈瑟菌ATCC、金黄色葡萄球菌ATCC,为本实验室菌库保存。
2.培养基:5%羊血琼脂培养基(SBA),5%兔血巧克力琼脂培养基(RChoc),5%羊血巧克力琼脂培养基(SChoc),含50μg/ml万古霉素的兔血巧克力琼脂培养基(Choc-V),淋病奈瑟菌培养基(NGA),MH培养基(MHA),5%羊血MH培养基(MHB),脑心琼脂培养基(BCA),营养琼脂培养基(NUA),中国蓝琼脂培养基(ZLA),DNA琼脂培养基均为本室自制。
3.试剂:蛋白胨、DNA琼脂粉、MH琼脂粉、VITEK-(NHI和GNI)鉴定试卡购自生物梅里埃公司。万古霉素为美国礼来公司产品,盐酸四甲基对苯二胺、3-乙酰吲哚购自SIGMA公司,Nitrocefin购自OXOID公司(英国)。氧化酶纸片(1%盐酸四甲基对苯二胺溶液浸泡纸片后吹干备用),乙酰酯酶纸片(mg/ml3-乙酰吲哚丙酮溶液浸泡50片纸片后吹干备用),Nitrocefin纸片(12.5μg/片Nitrocefin吹干备用)。
4.抗生素:哌拉西林(PIPC),齐鲁制药厂产品;氨苄西林(AMP),华北制药有限公司产品;哌拉西林/舒巴坦(PIPC/SBT)(4∶1),海口杰威药物研究所有限公司产品;哌拉西林/他唑巴坦(PIPC/TAZ)(8:1),美国立达公司产品;氨苄西林/舒巴坦(AMP/SBT)(2∶1),头孢哌酮/舒巴坦(CFP/SBT)(1∶1),美国辉瑞公司产品;亚胺培南/西司他丁(IPM/CST)(1∶1),美国默沙东药厂产品。
二、方法
1.菌株分离与鉴定:将可疑标本接种于SBA和Choc-V琼脂平板上,置5%CO2孵箱,35℃培养24～72h观察结果。细菌的分离培养和鉴定按文献进行,分离到的菌株经涂片革兰染色镜检、触酶、氧化酶试验后,用VITEK-(NHI和GNI)鉴定试卡鉴定到种。
2.氧化酶试验:按文献[5]进行。
3.DNA酶试验:按文献[5]进行。
4.乙酰酯酶试验:用无菌生理盐水将3-乙酰吲哚纸片沾湿,取待检菌落涂在纸片上,3min内出现蓝绿色为阳性反应。以MC的ATCC,全国临床检验中心质控菌株,,作为阳性对照。
5.生长指数(GI)测定:取经Rchoc平板24h培养的卡他莫拉菌ATCC菌落于2ml无菌盐水中,制成0.5麦氏单位菌悬液,再用无菌盐水进行1:10连续稀释,取10-5、10-6、10-7稀释度菌液μl分别接种在9种培养基上(Rchoc、Schoc、Choc-V、SBA、MHA、MHB、BCA、NUA、ZLA),分别置普通孵箱和5%CO2孵箱各1套,于35℃孵育24、48、72、96h,计数少于10个菌落平板上的菌落数,并用游标卡尺量出菌落直径,求其均值(mm),再乘以此最高稀释度的对数即得GI。
6.β内酰胺酶试验:用无菌蒸馏水将Nitrocefin纸片沾湿,取MC菌落涂在纸片上,5min内纸片变红色者判为β内酰胺酶阳性。7.药敏试验:根据美国临床实验室标准化委员会年版标准,采用琼脂平皿二倍稀释法测定最低抑菌浓度(MIC),用多点接种仪定量种菌。以金黄色葡萄球菌ATCC为质控菌株监测整个试验过程,质控值超出范围者,该批试验数据作废,找出原因后重复试验。
结果
1.氧化酶试验:株MC、15株淋病奈瑟菌、3株脑膜炎奈瑟菌、株奈瑟菌、24株莫拉菌、6株博德特菌氧化酶均为阳性,株不动杆菌氧化酶为阴性。
2.DNA酶试验:株MC中DNA酶全为阳性,15株淋病奈瑟菌、3株脑膜炎奈瑟菌、株奈瑟菌、24株莫拉菌、6株博德特菌、株不动杆菌中DNA酶均为阴性。卡他莫拉菌对DNA酶的敏感性为%,特异性为%。
3.乙酰酯酶试验:15株淋病奈瑟菌、3株脑膜炎奈瑟菌、株奈瑟菌、24株莫拉菌亚属、6株博德特菌乙酰酯酶均为阴性,株不动杆菌中乙酰酯酶阳性株(占82.6%),株卡他莫拉菌乙酰酯酶全为阳性。卡他莫拉菌对乙酰酯酶的敏感性为%,特异性为75.7%。但与近缘菌(淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、奈瑟菌属、莫拉菌亚属)比较特异性为%。
4.β内酰胺酶:株MC中β内酰胺酶阳性株,24株莫拉菌亚属β内酰胺酶阳性5株,15株淋病奈瑟菌、3株脑膜炎奈瑟菌、株奈瑟菌、6株博德特菌β内酰胺酶均为阴性。
5.不同培养基上的GI值比较:MC的ATCC在ZLA培养基上不生长;在MHA、BCA、NUA3种培养基上生长不良,分别经24,48,72,96h培养,与Rchoc琼脂培养基的GI值比较,差异有显著性(P0.05);MC的ATCC在Rchoc、Schoc、Choc-V、SBA、MHB5种培养基上经24,48,72,96h培养的GI值结果比较,差异无明显意义(P0.05);5%CO2环境与空气环境比较,对GI值结果影响不明显(P0.05)。结果如表1所示。
6.药敏试验:如表2所示,PIPC、AMP、PIPC/SBT、CFP/SBT、PIPC/TAZ、AMP/SBT、IPM/CST对卡他莫拉菌的MIC50和MIC90分别为0.5,4.0,0.06,0.5,0.06,0.,2.0,2.0μg/ml和2.0,8.0,0.25,1.0,0.25,2.0μg/ml;PIPC/SBT和PIPC/TAZ的MIC50和MIC90分别较单PIPC降低了8倍;AMP/SBTR的MIC50和MIC90较单AMP降低了32倍和4倍。
讨论
MC与许多严重感染性疾病有关,但由该菌引起的感染发病率一直难以估计。因为,MC生长较缓慢,在不含血的培养基(营养琼脂、MH琼脂、脑心琼脂)上生长不良,菌落及菌体形态与许多近缘菌相似,分离及鉴定较为困难。为此,提高MC分离率已成为临床诊断和治疗MC感染所急需。国外已建立起多种检测MC的方法,如丁酸酯酶法、MUB法、CONFIRM法及血清学检测法等。国内多采用DNA酶及硝酸盐还原试验将MC与近缘菌相区别,方法既繁琐又费时,结果也不易判断。我们采用3-乙酰吲哚纸片法检测MC产生的乙酰酯酶快速鉴定MC,此法操作简便,易于判断,敏感性为%,和近缘菌(淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、奈瑟菌属、莫拉菌亚属)比较特异性为%,与DNA酶试验及生化鉴定结果的相关性比较均为%。虽然不动杆菌的乙酰酯酶阳性率高达82.6%,但是不动杆菌的氧化酶阴性,DNA酶试验阴性,在普通琼脂及中国蓝琼脂上生长良好,且菌落较MC湿润和光滑,稍加注意不难区别。用3-乙酰吲哚纸片法检测MC产生的乙酰酯酶,3min即可出结果,成本较低,一片纸片可鉴定多个菌落,可用于可疑菌落的筛选,是临床实验室快速鉴定MC的良好方法,值得推广应用。
在9种临床实验室常用的琼脂培养基上比较MC的生长情况,试验结果表明,MC对营养要求较高,在不含血的MH培养基、脑心琼脂培养基、营养琼脂培养基和中国蓝琼脂培养基上生长不良或不生长。在5种含血的培养基上MC的GI比较结果显示,MC在巧克力琼脂培养基上比在血琼脂培养基上生长较好,GI值比较差异无显著性(P0.05);MC在不同血源巧克力琼脂培养基上的生长状况比较,兔血稍好于及羊血(P0.05)。为提高MC的分离率,我们采用含50μg/ml万古霉素的兔血巧克力琼脂培养基(加入万古霉素可抑制革兰阳性细菌的生长,增加了对MC的选择性)及5%CO2条件下对MC进行分离培养,并将培养时间延长到72h,分离率大有提高。
对株MC的β内酰胺酶检测结果分析表明,其阳性率高达93.0%,应引起临床医生的重视。哌拉西林/舒巴坦、氨苄西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦及亚胺培南/西司他丁对β内酰胺酶阳性MC有很好的抗菌活性。在MC感染的治疗中,应选用含β内酰胺酶抑制剂的复方制剂或用对β内酰胺酶头孢菌素进行治疗。MC的近缘菌(淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、奈瑟菌属、莫拉菌亚属等)中,β内酰胺酶的阳性率非常低,因此,β内酰胺酶试验也可作为MC与近缘菌的辅助试验。
参考文献
1.李光辉.卡他布兰汉菌研究现状.国外医学微生物学分册,,18:20.
2.ProstJ,ScavizziM.[Moraxella(Branhamella)catarrhalis.A
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